本发明公开了一种荷叶离褶伞多糖及其制备方法和应用，涉及生物医药技术领域。该荷叶离褶伞多糖的制备方法包括以下步骤：(1)荷叶离褶伞子实体加入含有EDTA‑2Na的水溶液，进行超声处理后，再经水提取处理，得到提取液；(2)对所述提取液进行浓缩后，加入无水乙醇沉淀，之后离心取沉淀，即得荷叶离褶伞粗多糖；(3)对所述荷叶离褶伞粗多糖进行除蛋白和透析处理，得到所述荷叶离褶伞多糖。本发明采用EDTA‑2Na辅助超声波法提取得到了一种荷叶离褶伞多糖。通过对本发明提取得到荷叶离褶伞多糖的药理活性进行研究发现，该荷叶离褶伞多糖具有调节免疫低下小鼠的肠道免疫功能的作用。