本发明涉及中医药制剂技术领域，具体公开了一种蟾酥提取物无胆固醇脂质体及其制备方法和应用。脂质体不含胆固醇，包括以下组分：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇衍生物和蟾酥提取物，其中，磷脂酰胆碱与磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇衍生物的质量比为21～32:20～31。利用蟾蜍内酯结构与胆固醇的相似性，采用蟾蜍内酯替代胆固醇，药辅合一，无胆固醇脂质体制剂处方增大了载药空间，该新型无胆固醇脂质体与普通脂质体相比包封率、载药量、稳定性均更高，贮存过程中渗漏率更低；同时，利用脂质体中水相内核，实现对水溶性药效成分蟾毒色胺类化合物的共载，充分发挥蟾酥中有效成分蟾蜍内酯类化合物抗肿瘤作用，蟾毒色胺类化合物的镇痛作用。