本发明公开了一种P450酶突变体、编码基因及其在制备皮质醇中的应用，属于生物工程技术领域。所述P450酶突变体是氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的智人来源CYP11B1通过氨基酸突变所得，氨基酸突变的位点为S146V、H331D、L440F中的至少一个。本发明提供的P450酶突变体相对野生型CYP11B1在大肠杆菌中具有更高的可溶性表达水平，构建的重组表达菌株的催化水平更高，可以以11‑脱氧皮质醇为底物制备皮质醇，产物的产率高，无副产物产生，具有很好的工业化应用前景。