本发明公开了一种非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)pK205R蛋白抗原表位肽，所述抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，本发明还公开了一种抗所述抗原表位肽的单克隆抗体及其制备方法和应用，属于分子生物学领域。本发明提供的抗原表位肽和单克隆抗体能用于非洲猪瘟病毒的检测，具有特异性好准确度高等优点，为研究非洲猪瘟病毒pK205R蛋白的生物学功能及开发检测方法提供了有价值的新工具。