本发明提供一种胶质菌分离纯化方法，包括以下步骤：将采集到的胶质菌样本进行清洗，灭菌处理；将完成清洗，灭菌处理的胶质菌样本进行切割，得到子实体样本；夹取并去除子实体样本的背面的菌丝块，以得到剩余的子实体接种块，将子实体接种块接种至第一培养基上；对第一培养基内的部分营养基质进行切割去除，露出培养皿的底部，以形成培养孔；将子实体接种块生长至培养孔内的菌丝样本取出，并转接至第二培养基上，以培养得到纯化菌丝。通过在第一培养基内切割部分营养基质形成培养孔，在培养孔内采集菌丝样本，可以有效减少由于胶质菌子实体因富含胶质，容易吸附细菌、酵母菌所带来的污染，提高纯化成功率。