本发明公开了eglin C多肽及其突变体在制备抑制新冠病毒Mpro蛋白酶的药物中的应用，涉及生物制药领域。该eglin C多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该eglin C的突变体是将eglin C多肽的第42位、第45位和第46位中至少一个位点的氨基酸进行定点突变得到。本发明研究发现该eglin C多肽以及本发明在该eglin C多肽基础上制备得到的eglin C突变体，具有抑制新冠病毒Mpro蛋白酶的活性，因此该eglin C多肽及其突变体可用于制备抑制新冠病毒Mpro蛋白酶的药物。