本发明涉及食品技术领域，具体公开了一种多层益生菌包埋颗粒及其制备方法与应用。本发明的益生菌包埋颗粒由内至外包括：液态菌液内芯、结构支撑层、固态油层和胶皮层；液态菌液内芯包括：第一油脂，第一菌粉和分散剂；分散剂包括纤维原料和酪蛋白酸钠，纤维原料同时包括菊粉和柑橘纤维；结构支撑层包括：第一胶体物质、壳聚糖和乳清蛋白粉；第一胶体物质同时包括果胶、明胶和结冷胶；固态油层包括第二油脂，第二油脂的凝固点为14‑25℃；胶皮层包括：第二胶体物质、甘油和海藻酸钙；第二胶体物质同时包括果胶、阿拉伯胶和魔芋胶。本发明的颗粒耐加工、活菌负载量高、储存稳定性佳。