本发明公开了一种黄素依赖型单加氧酶突变体及其在制备N‑羟基哌啶酸中的应用，属于生物工程技术领域。本发明的黄素依赖型单加氧酶突变体是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第123位、第181位、第379位进行单突变或多突变获得的。本发明经过半理性设计，对蛋白质进行分子改造，获得反应活性提高的突变体，有利于生成目的产物。本发明构建的突变体V123G和V123G/E181K/Y379S的酶活分别为野生型FMO1的116.8％和125.4％。对黄素依赖型单加氧酶催化活性的提高使其能够应用于系统获得性抗性信号分子N‑羟基哌啶酸的工业化生产，具有重要的意义。