本发明公开了一种咖啡酸‑3‑O‑甲基转移酶突变体及其在制备阿魏酸中的应用，属于酶工程和基因工程技术领域。本发明的咖啡酸‑3‑O‑甲基转移酶突变体是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第201位、第225位、第259位进行单突变或多突变获得的。本发明经过半理性设计，对蛋白质进行分子改造，获得催化活性提高的突变体，有利于生成目的产物。本发明构建的突变体G201P/L225K/W259A催化对咖啡酸时，阿魏酸的产量达到3.8g/L。对咖啡酸‑3‑O‑甲基转移酶催化活性的提高使其能够应用于阿魏酸的工业化生产，具有重要的意义。