本发明属于有机肥检测技术领域，尤其涉及一种氮同位素标记的土壤测试品及其制备方法。该制备方法包括以下步骤：获得土壤样品；分析所述土壤样品的含水量和含氮量以确定15N标记物的用量；根据15N标记物的用量确定有机碳源的用量；向所述土壤样品中加入所述15N标记物和有机碳源，培养一段时间；重复熏蒸、接种、培养步骤，直至各活性氮组分15N丰度R值的平均值在0.80‑1.60％范围内且各活性氮组分间的相对差异小于15％后，立即对土壤样品进行冷冻干燥，低温保存。该方法所得土壤测试品中各活性氮组分15N均匀分布，使精准定量评价有机肥N有效性成为可能，进而降低对有机肥N替代化肥N比例估计的误差。