本发明公开了一种同时测定全血中5'‑磷酸吡哆醛、甜菜碱和甲基丙二酸含量的试剂盒及方法，试剂盒包括干血斑采血纸卡、干血斑提取液、同位素内标和高效液相色谱流动相；其方法包括：采用干血斑采血纸卡采集全血制备干血斑样本；将干血斑样本放入离心过滤装置，加入提取液，涡旋提取，离心，得供试品溶液；通过高效液相色谱‑质谱联用分析，采用内标法测定。本发明基于干血斑技术，通过采用高效液相色谱‑质谱联用建立了一种能同时测定全血中5'‑磷酸吡哆醛、甜菜碱和甲基丙二酸含量的方法，该方法灵敏度高、重现性好、准确度高、分析速度快，且省去了繁琐的检测前处理步骤，检测成本低，可为大样本的人群的疾病的预防、诊断及治疗提供依据。