本发明提供基于生物素连接酶的蛋白邻近标记系统、方法及应用，该蛋白邻近标记系统包括含有生物素连接酶TurboID编码核苷酸序列的重组质粒、含有目标蛋白编码核苷酸序列的重组质粒以及用于诱导表达生物素连接酶TurboID和目标蛋白的细胞系。本发明利用含有生物素连接酶TurboID编码核苷酸序列的重组质粒和含有目标蛋白编码核苷酸序列的重组质粒在大肠杆菌中共表达，在体内进行邻近标记，纯化后直接获得一种Biotin‑EFTu（生物素标记的目标蛋白），经质谱鉴定，该生物素标记时为单一位点标记，标记效率高，表达完即标记完，不需要进行额外的操作，工艺简单，操作便捷，可为高通量表达与筛选蛋白提供思路。