本发明公开了一种用于预防多基因型丙型肝炎病毒的腺病毒载体疫苗，所述疫苗的有效成分为重组腺病毒，分别以Sad23L腺病毒和Ad49L腺病毒为疫苗载体。所述重组腺病毒的构件方法包括如下步骤：分别构件E‑1b、NS‑1b、E‑6a、NS‑6a蛋白穿梭质粒载体；将所述穿梭质粒载体与Sad23L和Ad49L进行DNA组装，得到重组腺病毒质粒；将步骤所得重组腺病毒质粒分别进行酶切后转染宿主细胞，包装、扩增、纯化后得到Sad23L和Ad49L重组腺病毒。Sad23L/Ad49L载体HCV疫苗既可以用同源抗原进行初次‑加强接种可以获得更高的HCV特异性抗体和T细胞反应；也可以用Sad23L/Ad49L载体HCV疫苗混合物进行初次‑加强接种，获得对Gt‑1b和Gt‑6a基因型的HCV的交叉反应性体液和细胞免疫，本发明极大推进了HCV疫苗的开发工作，具有广阔的使用前景。