本发明提供了使用检测微球测定样品中目标分子的浓度的方法，包括：提供微孔，至少一个检测微球的表面包含由第一配体‑目标分子‑报告分子形成的三明治结构；密封微孔并进行光漂白；获得微球图片，并对选定区域内的包含微球的微孔进行计数获得微孔总数；使隔离的微孔孵育预定的时间段，获得荧光图片；计算平均亮度值，作为特征值；获得特征值对浓度的标准曲线；根据所述标准曲线以及目标分子的特征值测定所述样品中的目标分子的浓度。本发明还提供相应的计算机可读介质和分析设备。本发明的方法不需要判断每个微球是否连接有目标分子，简化了方法的复杂度，同时维持了高检测精确度。