本发明公开一种利用二氧化碳合成PHA的工程菌及其构建方法与应用。本发明首先将来源于索氏甲烷丝菌GP6的Rubisco基因整合在基因组上，并将原有的启动子进行替换；再进一步将来源于杨氏柠檬酸杆菌ATCC 29220的氢化酶基因整合在基因组在上，为了进一步提高PHA产量将竞争途径乳酸脱氢酶基因进行敲除，同时过表达PHA合成基因。本发明提供的工程菌株采用高密度发酵培养方法，在5L发酵罐中PHA的产量可达细胞干重的83.5％，且细胞干重达到22.14g/L。本发明对于PHA的工业化生产具有重要的应用意义。