本发明提供了一种利用D‑木糖为底物生物合成D‑核糖的方法。涉及生物化工领域，其特征在于，以木糖为底物，以大肠杆菌为底盘细胞，通过构建3步酶级联反应，将D‑木糖转化为D‑核糖。通过筛选D‑木糖向D‑核糖3步转化途径中有活性的异构酶，分别为：D‑木糖/D‑葡萄糖异构酶(D‑XI/GI,EC 5.3.1.5)、D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶(D‑PE,EC 5.1.3.30)、醛糖‑酮糖异构酶(EC 5.3.1.‑)，利用上述3种酶构建共表达质粒，构建出产D‑核糖的工程菌BL21/pET28a(PB)N‑XylA‑CcDPE‑Bs‑L‑RhI。结果表明，菌株BL21/pET28a(PB)N‑XylA‑CcDPE‑Bs‑L‑RhI作为全细胞催化剂，可以将D‑木糖转化为D‑核糖，以50g/L D‑木糖为底物，合成了1.522g/LD‑核糖。本发明是一种替代戊糖磷酸途径生物合成D‑核糖方法，进一步的转化工艺优化有望大幅提高D‑核糖的产量和转化率。