本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及一种可用于山茶亚属近缘种亲缘关系分析的cpDNA基因间隔区分子标记；包括山茶属近缘种(浙江红山茶、南山茶、小果油茶和短柱茶)叶绿体基因组的测序与比较，叶绿体基因组高变异基因间隔区的获取与分子标记开发，最后筛选获得5个高变异的叶绿体基因组分子标记Cc_petN‑psbM、Cc_trnS‑trnR、Cc_ycf3‑trnS、Cc_rrn5‑trnN、Cc_trnN‑ndhF。本发明可用于山茶属物种的系统发育研究，且具有优秀的通用性，尤其适合针对油茶树种集中分布的山茶亚属的油茶组、红山茶组和短柱茶组近缘物种间的系统发育关系分析，是一种可靠有效的分子标记。