本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种视网膜色素上皮细胞分离装置及分离方法。该视网膜色素上皮细胞分离装置，包括：主体内具有空腔，空腔内具有磷酸缓冲盐溶液，主体的一端具有开口；分离组件包括连接杆和分离件，分离件内具有放置眼罩的腔体，腔体内设置有滤网，腔体通过滤网与空腔连通，分离件设置在空腔内并浸泡在磷酸缓冲盐溶液内，连接杆的一端设置在空腔内与分离件固定连接，连接杆的另一端伸出开口，分离件具有靠近开口和远离开口的两种状态，连接杆的另一端适于在外力驱动下使分离件在两种状态下进行切换。使视网膜色素上皮细胞与眼罩进行分离，通过滤网流入磷酸缓冲盐溶液中，起到快速分离视网膜色素上皮细胞的目的。