本发明属于荧光标定板技术领域，提供了一种吲哚菁绿水凝胶荧光标定板及其制备方法和应用，包括：将海藻酸钠溶解于聚乙烯醇溶液中，向混合液中加入丙烯酰胺和纳米纤维素悬浮液，随后加入引发剂和交联剂发生交联反应得到水凝胶溶液；将吲哚菁绿加入水凝胶溶液中得到混合凝胶溶液；低温冷冻后置于室温下解冻得到中间凝胶；随后浸泡于硅酸钠的乙醇水溶液中，取出清洗得到水凝胶；配制多组含吲哚菁绿的水凝胶，并分别注入试样管中，固定于多孔板内，将多孔板重复冻融至少三次。本发明可以极大地提高吲哚菁绿在水凝胶体系中的稳定性，不易发生光漂白和降解，从而保持荧光标定板长期稳定的荧光强度。