一种基于基片表面自干涉的焦面锁定方法及装置，包括激光器、透镜组、分束器、四分之一波片、压电位移台、基片、载物台、成像物镜、相机和计算机或图形处理器。基片表面起伏结构的散射光与透射光或反射光发生干涉，形成散斑图像，散斑图像随成像物镜焦面的移动而变化。通过采集成像物镜焦面各位置处的散斑图像形成图像堆栈，并计算当前时刻散斑图像与图像堆栈中散斑图像的相似度，可确定当前成像物镜的焦面位置，并进一步实现焦面锁定的功能。本发明提供一种通过光学手段实现焦面锁定的方法及装置，具有装置简单、样品制备流程简单、装置简单、与各类光学系统兼容性强的优势。