本发明属于农药残留检测技术领域，具体涉及一种农药残留检测卡及其制备方法与应用。本发明采用聚乙烯醇溶解膜来调控抑制反应、显色反应的发生，确保乙酰胆碱酯酶先与待测液发生抑制反应后再进行显色反应以提高农药残留检测卡的灵敏度。且本发明采用数字化方式制备农药残留检测卡，采用该制备方法能够制备出高通量、强稳定性的农药残留检测卡。同时本发明通过大量试验数据证明该农药残留检测卡具有操作简单、快捷，灵敏度高、重现性好、稳定性强等优势，适用于检测有机磷及氨基甲酸酯类农药残留量。