本发明公开了一种空间组学芯片及其制备方法、以及样本中目标分子的检测方法，所述空间组学芯片的制备方法包括以下步骤：构建2~4条种子探针，再合成种子探针文库；其中，每条种子探针包括依次连接的第一接头、接头测序引物、空间编码、空间编码测序引物和第二接头，每条所述种子探针的空间编码测序引物之间不存在大于4个碱基的同源或互补序列；将种子探针文库进行混合，与固定于芯片基底的寡核苷酸进行杂交，再扩增形成包括不同空间编码测序引物的探针簇；根据种子探针的数量，进行相应次数的测序；在所述探针簇的末端生成mRNA捕获序列。本发明的空间组学芯片可以提高分辨率且保证测序质量。