本发明属于微生物发酵技术领域，具体提供了一种高活性厌氧污泥的驯化方法，包括以下步骤：(1)取反刍动物瘤胃液，过滤去除杂质，灌入到通有惰性气体的缓冲液中，摇匀后恒温孵育；(2)将孵育后的瘤胃液与厌氧污泥混合，密闭厌氧放置后，加入原料进行厌氧发酵驯化，重复多轮添加原料并进行厌氧发酵的步骤，得到高活性厌氧污泥。本发明提供的这种高活性厌氧污泥的驯化方法驯化周期短、稳定好、产甲烷菌丰度高，提高了产气速率和产气量，缩短了体外发酵时间。此外，采用该方法获得的高活性厌氧污泥可以代替瘤胃液应用到纤维饲料原料的体外饲用价值评估，成本低，能满足大批量的需求。