本发明涉及预制箱梁加工领域，具体为一种预制箱梁预应力作业系统及作业方法，包括AGV小车、安装在AGV小车上的移动梁架以及安装在移动梁架中的执行机构基座，AGV小车的后侧设置有固定装置，AGV小车的内部开设有活动槽，活动槽的内部固定安装有推动固定装置前后移动的液压推杆，执行机构基座的后侧安装有夹持装置。本发明通过设置固定装置，在AGV小车与预制箱梁居中定位完成后，通过单一驱动源驱动电机驱动内固定机构和外固定机构同时从预制箱梁的内外两侧进行固定作业，并且在对预制箱梁内外两侧同步固定的过程中，连接机构还能够将内固定机构和外固定机构锁定连接在一起，实现预制箱梁内外两侧的联合固定，提高对锚穴预应力作业的准确性。