本发明公开了一种表达H9N2亚型AIV HA基因的重组I型马立克病病毒株及其构建方法和应用。本发明利用重组克隆技术，将包含SV40启动子、H9N2亚型AIV HA基因及终止子序列的基因片段SV40‑HA插入MDV基因缺失疫苗株（rMSΔMeq株）UL41基因内部，并替换rMSΔMeq基因组序列的96927‑97106位核苷酸序列后，获得在UL41基因内部插入SV40‑HA表达框的重组黏粒，由其拯救获得表达H9N2亚型AIV HA基因的重组Ⅰ型MDV株——rMDV‑HA。研究表明，rMDV‑HA具有与亲本病毒株同等的体外复制能力以及良好的遗传稳定性，免疫鸡后可对H9N2亚型AIV以及MDV提供良好的保护效果。本发明的提出为制备同时预防H9N2亚型AIV以及MDV感染的药物提供了技术手段。