本发明公开了一种高蛋白酵母选育的高通量筛选方法及应用，属于微生物技术领域。本发明提供的高通量筛选方法为在宿主细胞中游离表达gfp基因和rfp基因，利用荧光强度表征宿主细胞的蛋白含量。所述宿主细胞可以是具有较高蛋白含量的酿酒酵母野生型或工程菌株。本发明还公开了筛选方法在高蛋白酵母工程菌选育中的应用，可以实现从104～105规模的诱变文库快速筛选。该方法选育的酿酒酵母为非转基因菌株，可以应用于安全要求较高的食品工业蛋白生产中。