本发明提供了一种支原体突变株及其制备方法与应用，所述支原体突变株中同时含有两个LoxP和一个FRT位点，FRT位点位于两个LoxP位点之间；或者同时含有一个LoxP和两个FRT位点，LoxP位点位于两个FRT位点之间；所述LoxP和FRT位点位于非开放式阅读框中。还包括制备支原体突变株所用的载体，制备单基因缺失株所用的载体以及构建单或多基因缺失株的方法。更进一步的，本发明还提供了用来制备无外源基因表达的基因缺失型支原体的方法。通过本发明的技术方案，可以高效的利用FRT或者LoxP位点制备各种感兴趣的基因缺失株。并可进一步的制备无外源蛋白表达的基因缺失型支原体。与现有技术相比本发明实验成本低，实验效率高，实验周期短，不需要先建立支原体缺失株文库。