本发明提供了以热熔胶为基质的黄栀理伤贴膏中赤芍、羌活与栀子的薄层鉴别方法，属于药物鉴别技术领域。本发明制备供试品溶液时采用水蒸气蒸馏法对以热熔胶为基质的黄栀理伤贴膏进行提取，能够充分提取制剂中有效成分并避免热熔胶基质对有效成分的干扰，然后采用正丁醇水溶液进行萃取，能够有效分离目标成分并排除非极性杂质化合物干扰，之后采用C18固相萃取柱分离，能够有效排除极性杂质化合物干扰。同时本发明采用羌活对照药材，灵敏度高、斑点更清晰且成本更低。而且本发明采用特定展开剂能够高效分离三味药物的指标性成分，避免了三味药物单独制样，操作简单、检测周期短、检测效率高。此外本发明采用加压雾化方式显色，显色效果更佳。