本发明提供了一种高通量筛选sgRNA骨架(sgRNAscaffold)活性突变体序列的系统和方法，属于生物工程技术领域。所述体系包含Cas蛋白表达载体和sgRNA骨架突变体筛选载体；所述Cas蛋白表达载体上包含以下表达元件：Cas蛋白编码基因、质粒复制子、以及第一抗性筛选标签表达盒；所述sgRNA骨架突变体筛选载体包含以下表达元件：复制子、第二抗性筛选标签表达盒、第三筛选标记表达盒、用于表达sgRNA骨架序列的启动子和终止子。所述系统和方法可以应用于CRISPR基因编辑系统sgRNA骨架元件的筛选，利用本方法，能够得到序列多样的sgRNA骨架，进而应用于多靶点基因编辑、多基因转录调控、菌株库构建等领域，拓展CRISPR基因编辑系统的应用领域和编辑效率。