本发明公开了一种基于16S rRNA高通量测序技术对热应激环境下鸡肠道微生物的检测方法，属于微生物技术领域。将鸡在高温环境下进行饲养，利用16S rRNA高通量测序技术对高温饲养结束后的鸡肠道菌群进行检测，以常温条件饲养的鸡为对照，分析热应激环境下的鸡肠道微生物的变化。本发明通过对照组和热应激组母鸡育成至产前期盲肠肠道微生物的差异比较分析发现，热应激状态下，盲肠肠道菌群减少1个属，1019个ASVs细菌阶元。热应激后肠道微生物中的拟杆菌属丰度增加、理研菌科RC9肠道菌属丰度降低，考拉杆菌属丰度差异显著。热应激后肠道次生代谢的生物合同通路和感染疾病通路因子丰度明显降低。