一株大肠杆菌及其制备重组人源Ⅲ型胶原蛋白的方法，大肠杆菌为大肠杆菌hf_#imgabs0#M_E.coli_rCOL3A1，已保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏日期为2023年9月25日，菌种保藏编号为CCTCC NO:M 20231780。本发明所选择的序列完全来自于人的Ⅲ型胶原蛋白区域，在不影响氨基酸序列的前提下进行密码子的优化；采用大肠杆菌表达系统，生产成本较低；将目的蛋白与蛋白融合标签进行连接，大大提高蛋白的可溶性，解决了包涵体的问题；目的蛋白纯度与产量较高，发酵产量可达到911 mg/L目的蛋白；本发明所获得的重组人源Ⅲ型胶原蛋白序列及结构更接近于人体Ⅲ型胶原蛋白，有着良好的生物活性和较低的免疫原性。