本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种NK细胞体外高效扩增方法及应用。包括：S1、单个核细胞分离；S2、灭活血浆；S3、接种、激活NK细胞：S3.1、第0天，用激活培养基M1重悬细胞，种瓶、培养；S3.2、第3天，补加激活培养基M1，培养；S3.3、第5天，补加激活培养基M2，培养；S4、扩增NK细胞；S5、收获NK细胞；其中：激活培养基M1添加有CD16抗体、HER2抗体、IL‑15、IL‑18、IL‑21和IL‑2，IL‑2的浓度为0～500IU/ml。本发明方法NK细胞扩增效率高，NK细胞CD3‑CD56+/CD16+表达率高达95％以上，NK细胞体外杀瘤活性显著，可满足临床应用的需求。