本发明涉及乳酸脱氢酶同工酶技术领域，特别是涉及乳酸脱氢酶同工酶1检测试剂盒、检测方法。乳酸脱氢酶同工酶1检测试剂盒，包括如下浓度的R1试剂和R2试剂，R1试剂包括L‑乳酸60～100mmol/L，硫氰酸胍100～300mmol/L；R2试剂包括辅酶I 1～10mmol/L。检测方法，在检测过程中，试剂盒适用仪器的检测条件包括：设置主波长为：340nm，副波长为410nm；比色杯光径为1.0cm；速率A(RATE A)；上升反应。本发明能提高乳酸脱氢酶同工酶1检测试剂盒的稳定性。