本发明公开了一种敲除14‑3‑3ε基因的LMH细胞系及其构建方法和应用，包括如下步骤：设计特异性靶向鸡源14‑3‑3ε基因的sgRNA；构建含有Cas9蛋白基因和特异性靶向鸡源14‑3‑3ε基因的sgRNA的敲除质粒；将构建的敲除质粒对LMH细胞进行转染，筛选培养后获得14‑3‑3ε基因敲除的LMH细胞系。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑，成功获得鸡源14‑3‑3ε基因敲除LMH细胞系，发现该细胞系能够有效促进血清4型禽腺病毒的感染复制，该细胞系生长活性与正常LMH细胞无明显差异。本发明为探究鸡源14‑3‑3ε生物学功能以及解析14‑3‑3ε在FAdV‑4的感染复制中的作用打下了基础。