本发明公开了一种抗AMH蛋白的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)以AMH蛋白为免疫原，以6周龄BALB/c雌性小鼠为对象进行免疫；选取效价高的免疫小鼠进行加强免疫；(2)取小鼠的脾脏，制备脾脏细胞悬液，与处于对数期的SP2/0骨髓瘤细胞混合，进行细胞融合，培养，得到能稳定分泌特异性抗AMH蛋白抗体的杂交瘤细胞株；(3)选取8～10周龄的BALB/c雌性小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂，7天后注射杂交瘤细胞株，抽取小鼠腹水，提取、纯化，即得抗AMH蛋白的单克隆抗体。本发明的抗AMH单克隆抗体的制备方法能够得到效价高、亲和力强、特异性好的单克隆抗体，本发明为AMH的临床诊断提供了辅助。