本发明涉及合成生物学技术领域，具体公开制备胞磷胆碱用重组菌及其应用，所述重组菌包括能够表达胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶编码基因的重组菌A，在ATP和CTP共底物条件下催化氯化胆碱形成胞磷胆碱；能够表达胞苷激酶、胞苷酸激酶和核苷二磷酸激酶编码基因的重组菌B，在ATP共底物条件下催化CR形成CTP以及能够表达多磷酸AMP磷酸转移酶、多聚磷酸激酶和焦磷酸水解酶编码基因的重组菌C，直接以六偏磷酸钠为底物催化AMP/ADP形成ATP，并降解焦磷酸为磷酸促进胞磷胆碱的合成。本发明提供的重组菌应用在产胞磷胆碱中，仅需添加与氯化胆碱浓度等摩尔比的胞苷和5％摩尔比的单磷酸腺苷作为共底物，就能获得高浓度的胞磷胆碱，实现胞磷胆碱的高产量以及氯化胆碱和CR的高转化率。