本发明公开了一种猴头菌沪猴28号菌株MNP标记的多重PCR扩增及其基因型鉴定方法，包括以下步骤：S1、菌丝培养：将猴头菌菌丝转接到PDA平板上，25℃下避光培养，15d后收集菌丝；S2、基因组DNA的提取：用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度为100～200ng/uL；S3、多重PCR扩增：将MNP标记引物组内的10对引物等量混合后对上述提取的DNA进行多重PCR扩增。本发明通过对猴头菌‘沪猴28号’菌种的多重PCR扩增及其MNP标记基因型鉴定可对‘沪猴28号’菌种进行鉴别，与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有准确性高、特异性强、可重复性好的优点。