本发明提供一种同时检测尿液样品中90种类固醇激素及其代谢物的试剂盒、检测方法及样品预处理方法，所述试剂盒包括90种类固醇激素及其代谢物混标工作液、内标工作液、基质、复溶剂和洗脱液，还包括液液萃取剂、稳定剂、酸性溶液、缓冲液和酶解液。本发明采用酶解液对尿液样品酶解，并结合液液萃取、超高效液相色谱‑三重四级杆串联质谱方法，针对每种类固醇激素分别进行定性分析和定量分析，标准曲线的R2均大于0.990。本发明突破性地实现了对尿液样本中90种类固醇激素及其代谢物的同时检测。操作简便快速，通量高，能实时精确有效地监测人体尿液中类固醇激素及其代谢物水平，具有广泛的应用前景。