本发明属于微生物分子检测领域，公开了一种基于新分子靶标同时检测多种李斯特氏菌的多重qPCR试剂盒及方法。本发明基于基因组学挖掘得到的各李斯特氏菌特异性基因片段设计对应的引物和探针，建立多重qPCR方法并组装为便携试剂盒。本发明的多重qPCR引物探针组具有很高的特异性，仅对单核细胞增生李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、威氏李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌和格氏李斯特氏菌六种目标菌在特异性的荧光信号通道检测出现荧光信号，检测结果更准确。本发明的多重qPCR试剂盒14 h内即可完成样本检测，其中qPCR全程仅需约1 h，检测效率高、检测成本低，特别适用于大规模样品的摸底排查和实际检测，检测灵敏度可低至1.0～11.1 CFU/Test。