本发明公开了一种基于多孔微球的益生菌制剂及其制备方法和应用，创新性的将孔洞结构微球通过直接添加的方式应用在益生菌制剂的制备中，并提出菌种的填充式培养。所述益生菌制剂的制备方法包括以下步骤：(1)将多孔微球与单宁酸‑Ca2+溶液混合得到修饰后多孔微球；(2)将益生菌接种至含有所述修饰后多孔微球的发酵培养基中进行黏附共培养，得到第一发酵液，更换新鲜发酵培养基，进行填充式培养，得到第二发酵液；(3)将所述的第二发酵液离心取沉淀，先后加入粘蛋白溶液和脱脂奶粉溶液混合，即得益生菌制剂。本发明提供的制备方法所制备的益生菌制剂，能够充实微球孔洞内益生菌黏附，大幅提高益生菌含量，保证益生菌活性。