本发明公开了一种高产棘白菌素B的基因工程菌株构建方法和应用，所述工程菌株以厚冠突曲霉菌为底盘菌，在底盘菌中高表达ecdA基因和/或htyF基因所得。本发明提供一种高产棘白菌素B的基因工程菌株，本发明利用ecdA和htyF联合高表达提升棘白菌素B发酵产量，运用分子生物学的方法将原始菌株中的ecdA原始启动子替换为组成型强启动子gpdA，获得ecdA高表达工程菌株；在此工程菌株上对htyF高表达，获得ecdA与htyF共同高表达工程菌株。本发明构建的工程菌株均强化棘白菌素B合成途径，显著提高了Aspergillus pachycristatus的棘白菌素B产量，具有潜在的工业应用价值。