本发明提供了一种基于生物层干涉的高通量群体靶向类固醇雌激素检测方法，能够实现对水中类固醇雌激素的高灵敏群体靶向识别检测。通过指数富集配体系统进化技术筛选获得类固醇雌激素的核酸适配体，并对其进行核苷酸特异性编辑，构建第一适配体和第二适配体。将第一适配体固定于链霉亲和素传感器表面，第二适配体特异性结合靶标类固醇雌激素形成第二适配体‑类固醇雌激素复合物。在检测过程中，链霉亲和素传感器上的第一适配体捕获第二适配体‑类固醇雌激素复合物，导致传感器尖端生物层厚度变化，由此引发的波长偏移可定量水中类固醇雌激素的浓度。该方法可同步识别雌酮、17β‑雌二醇和炔雌醇，检测浓度范围为0.001~1 nM，检测时间为10分钟。