Un procédé de caractérisation de microorganismes présents dans un échantillon biologique comprenant l'acquisition d'une image numérique holographique en ligne de l'échantillon, la génération, d'une image focalisée par l'application d'un modèle numérique de reconstruction d'image focalisée et la caractérisation des bactéries à partir de l'image focalisée. Selon l'invention préalablement à l'acquisition de l'image holographique une pluralité d'objets de calibration sont fournis dans le champ de vision de l'acquisition, objet préalablement caractérisés en dimension et en indice de réfraction et une forme choisie à ce que les figures d'interférence des objets sont calculables en utilisant un modèle de formation d'image intégrant des aberrations optiques du dispositif d'acquisition. Préalablement à la génération informatique de l'image focalisée, une quantification des aberrations optiques est obtenue en fonction des figures d'interférence des objets et les figures d'interférence calculées et le modèle numérique de reconstruction de l'image focalisée intègre les aberrations optiques quantifiées.