一种可快速解离型三维细胞培养载体及制备方法。是以羧甲基改性的壳聚糖为原料，将其溶解于pH＝5～8的磷酸盐或2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中，然后加入碳二亚胺活化的二硫代二元酸交联剂，通过羧甲基壳聚糖中氨基与交联剂中羧基间的酰胺化反应形成三维化学交联的水凝胶，最后通过冷冻干燥得到三维多孔载体。该载体材料中的二硫键可被其还原剂迅速还原断裂，实现多孔载体快速解离而溶解，能满足多种体外三维细胞培养和培养结束后需要细胞-载体材料有效分离的特殊需求。本发明的壳聚糖基水凝胶三维细胞培养载体具有原料易得、工艺简单、易生物活性改性，以及载体理化性质、力学性能和降解速率可控等优点，在各种三维细胞培养中具有良好的应用前景。