本发明涉及一种分离食用菌菌种的方法，包括以下步骤：将子实体露出新鲜无菌组织，在无菌组织面上，用锋利的尖端划块，并斜插入组织内用尖端掰离；试管斜面朝下，拔掉棉塞，镊子夹住组织块在火焰上轻快来回烧燎2-3次放入试管，塞上棉塞；最后，试管倾斜，分离培养基面朝下，把组织块轻轻震动，使组织块从试管口直接滑落在培养基试管底部，卡在培养基与试管中间，然后将试管放置在22-28℃的温度下，3d即可萌发菌丝；8-12d菌种即可转接。本发明的分离方法在开放的环境即可操作，不需特殊设备；另外表面处理不用消毒剂(如酒精)，直接用镊子夹住在酒精灯火焰上均匀过一下，使表面灰尘及杂菌用火焰烧灼一下即可；组织块不用经过培养基上方，大大降低污染率。