本发明涉及用于检测结核分枝杆菌及其耐吡嗪酰胺药性的引物组，利用该引物组检测结核分枝杆菌的耐吡嗪酰胺药性的方法是：提取样本中的DNA；通过荧光定量PCR扩增含有全长吡嗪酰胺酶基因(pncA)的结核基因组片段来检测结核分枝杆菌；对结核分枝杆菌阳性样本，进行吡嗪酰胺耐药性的检测，该检测的步骤为，1.以荧光定量PCR产物为模板再进行一次PCR反应添加体外表达元件；2.将此PCR产物加入到无细胞表达系统中，表达吡嗪酰胺酶；3.通过该样本与标准菌株的吡嗪酰胺酶活性对比，给出吡嗪酰胺耐药性结果。本发明将荧光定量PCR扩增全长pncA基因结合体外表达的吡嗪酰胺酶酶活性，实现了样本中结核分枝杆菌及其吡嗪酰胺耐药性的联合检测,无需细菌培养和DNA测序仪。