本发明公开一种细菌胞内谷胱甘肽含量的测定方法，包括以下步骤：绘制不同浓度谷胱甘肽与荧光强度的标准曲线；采用平板菌落计数法进行菌落计数；设置待测菌液实验组和背景荧光对照组；将实验组和对照组处理后，采用荧光强度检测法进行检测；据标准曲线，计算出样品谷胱甘肽含量，根据平板计数计算出样品细菌数量；谷胱甘肽含量与相应细菌数量的比值即为一定个数细菌胞内谷胱甘肽的量。本发明采用mBBr试剂，其能通过革兰阳性菌细胞壁并进入细胞与谷胱甘肽结合，生成稳定的荧光衍生物，之后通过乙腈裂解细菌，解决了测量方法中革兰阳性菌破壁困难的问题。