本发明涉及对普罗威登斯菌O3，O4，O8，O12，O13和O20血清型特异的核苷酸及其应用，所述核苷酸为SEQ ID NO:1-12所示的核苷酸中的至少一种。这些核苷酸可用于制备检测普罗威登斯菌用PCR试剂盒和基因芯片。所述的普罗威登斯菌可以取样于腹泻大便、尿道感染、伤口、烧伤和菌血症标本的培养物的粗提液，或是普罗威登斯菌的纯培养物的粗提液等。本发明对普罗威登斯菌O3，O4，O8，O12，O13和O20血清型特异的核苷酸及包含该核苷酸的PCR试剂盒、基因芯片，PCR试剂盒配制方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强，易于产业化生产，而检测成本却相对较低；准确性高；灵敏度高。