本申请公开了一种非洲猪瘟病毒基因II型毒株单克隆抗体及其制备方法和应用。本申请的制备方法，包括用纯化p54免疫蛋白对小鼠免疫，取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，用三种筛选抗原进行筛选，获得可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，再通过体内或体外的方法制备单克隆抗体；三种筛选抗原包括，原核表达p54重组蛋白、真核表达p54重组蛋白和人工合成的Seq ID No.1所示多肽。本申请，用三种筛选抗原对杂交瘤细胞进行筛选，特别是人工合成特别针对基因II型毒株的多肽作为筛选抗原，使制备的单克隆抗体能够保障基因II型毒株的检测率，减小了漏检概率，提高了检疫工作质量和效率。