本发明公开了一种抗生物粘附多孔分离膜、其制备方法及应用。该抗生物粘附多孔分离膜是表面含有环氧基的多孔聚合物膜与氨基酸的伯胺基进行环氧开环反应，得到在pH 7左右呈两性离子特征的平板型或中空纤维型多孔膜。制备方法是，表面含有环氧基的聚合物多孔膜浸泡于含有氨基酸的溶液中，在弱碱性条件下进行环氧开环反应，然后调节pH为5~9左右，得到表面含有胺基阳离子和羧酸根阴离子的抗生物粘附多孔分离膜。该分离膜具有抗生物粘附特点，可以用于分离纯化。